质粒构建（五步学会质粒构建原理）

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原百思特网理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。

1.质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

补水至50ul，37C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

双酶切1和2，在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer的问题，可在NEB公司主页的Double Digest Finder里面进行查询。

2.根据目的序列构建引物后，如果目的基因片段只有几十kb的话，可以选择退火方式使插入片段成为互补序列。

（1）引物设计方法：举个栗子，比如选择的限制性内切酶为BglII与HindIII，则根据酶切位点序列在引物的两端加粘性末端碱基序列。

引物合成形式：5’-GATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGA-5’

（2）在PCR仪中按照以下touch down程序运行95C, 5 min; 95–85C at −2C /s; 85–25C at −百思特网0.1C /s; hold at 4C。

3.线性化质粒载体与退火产物进行T4 DNA酶连接。

T4 DNA酶百思特网连接一般选择 16℃过夜。

注：连接可以选择公式计算，一般按照最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量 = [0.02克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)

最适插入片段使用量 = [0.04插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)

4.转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a）,涂板,培养过夜。注意质粒的抗性，选择对应的平板。

5. 挑取单克隆,并鉴定

挑去平板上的单克隆培养,可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步

鉴定出来的阳性克隆进行测序。