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lncrna引物设计（lncRNA的套路分析）
摘要
非编码RNA (ncRNA) 参与表观遗传调控，但了解甚少。在这里，我们在11个解剖部位以5个碱基对分辨率描述了4个人类HOX基因座的转录景观特征，并鉴定出231个HOX ncRNAs, 它们将已知的转录区域延伸超过 30 千碱基。HOX ncRNAs沿发育轴空间表达，拥有独特的序列模体，其表达界定了差异组蛋白甲基化和RNA聚合酶可及性的广泛染色体结构域。
研究结果
图1
图1：HOXA位点的人类HOX转录组。
(A) 位点特异性转录。左：50532个探针的杂交强度，这些探针对11个样本中的每个样本的人 HOXA基因座进行拼接（用圆圈编号）。每个探针的强度显示为单个探针强度的比值除以阵列上所有301,027个探针的平均强度的log2每个探针的 log2比率取100 bp窗口的平均值；红色和绿色条分别表示高于或低于阵列平均值。蛋白编码HOX基因的基因组位置显示为棕色框。右：11 个成纤维细胞样本关于发育轴的解剖学来源。
(B) 转录区域通过瓷砖阵列上的连续信号识别，然后与 Refseq 序列比较以确定基因 [外显子（粉色）和内含子（蓝色）] 和基因间转录区域（紫色）。每个预测的HOX外显子或内含子分别被命名为HOXn或int-HOXn。基因间转录区域命名为 nchoxn，其中n是HOX编码链上位于ncRNA 3′ 端的 HOX paralog。
(C) 所有四个HOX基因座的转录区域总结，定义了 HOX 基因、内含子和ncRNA转录区域的数量。
图2
图2：HOX ncRNA的位点特异性表达和一级序列模体。
(A) HOX编码的转录本沿着近端-远端轴差异表达。60个转录区域（12个HOX基因和48 个 ncRNA）在远端成纤维细胞样本（足部、手指、包皮和前列腺）和所有其他细胞之间差异表达（P < 0.05，Student t 检验）。以色阶表示高于或低于总体中位数的每个转录区域的表达水平（线性刻度上为3倍至0.3倍，或log2刻度上为 + 1.6 至-1.6 倍）。转录区域按其沿染色体的位置排序，样本通过这60个转录本的表达相似性进行分层聚类。HOX的旁系同源基因进化起源到飞翔超胸 (UBX) 或触角腹 (Antp) 分别用蓝色和黄色方框表示。
(B)HOX编码的转录本沿着前后解剖分区差异表达。总共有92个转录本（6 个 HOX 基因，86 个 ncRNA）在前或后原代成纤维细胞培养（脐上或脐下）中差异表达（P < 0.05，Student t 检验）。每个 ncRNA 的表达如 (a) 所示。
(C) 基于其表达模式，HOX ncRNA中富集的序列基序 (p < 10-9)。ncRNAs 一级序列中富集的序列基序的Logograms超过非转录的HOX序列，或者在ncRNAs的远端，近端，或后面的表达模式。在前部解剖部位表达的ncRNA没有比预期更多的一级序列模体。
图3
图3：在HOXA基因座占据Suz12,H3K27me3, 和pol II与在原代肺（上）或足（下）成纤维细胞 (Fb) 的 HOXA 基因座的 ~100 kb 转录活性上完全相反的染色质修饰和转录可达性。对于芯片数据，芯片/输入的 log2 比绘制在 Y 轴上。对于 RNA 数据，以线性比例显示杂交强度。虚线突出显示染色质修饰和基因间转录相反构型的边界。
图4
图4：HOXC位点反义基因间长ncRNA HOTAIR。
(A) HOTAIR在两个染色质结构域边界的基因组位置。芯片和RNA在拼接阵列上的表达如图 3 所示。
(B)链特异性RT-PCR显示HOXC基因相反链的 HOTAIR的唯一表达（底部）。设计逆转录 (P-RT)和PCR(P-PCR) 的引物，专门针对HOTAIR 的顶端（引物F1-F3）或底部链（引物R1）。
(C)肺和包皮成纤维细胞RNA中热空气的 Northern印迹分析。
(D) 大小片段小RNA用包含HOTAIR寡核苷酸池（1-3组），全长反义HOTAIR 或 miRNA let7a 探针探测。
(E) 用qrtpcr 检测HOTAIR在人纤维母细胞的后部和远端表达。每份成纤维细胞样本的来源部位由解剖卡通上的样本编号表示。“A”来源于头皮。每个位置相对于头皮（最前面）的热风相对丰度显示在 X 轴上。
(F) 在胚胎10.5天全胚胎（上图）和后肢及尾部（左下图和右下图）中使用HOTAIR sense（底链）或antest（顶链）探针进行全胚胎原位杂交。HOTAIR在后肢（箭头）和尾部（箭头）的表达突出显示。
图5
图5：HOXD位点H3K27三甲基化和Suz12占位需要 HOTAIR。
(A) HOXD基因座上H3K27me3 ChIP-ChIP信号的变化是由HOTAIR的耗竭引起的，与针对GFP 的对照siRNA相比。HOXD基因的位置用棕色框表示。
(B) 靶向GFP或HOTAIR的siRNA处理后，H3K27me3的ChIP和HOXD位点选择性启动子的 Suz12。底部：ChIP检测定量（平均值标准误差）。
结论
我们在HOXC基因座中发现了一个2.2千碱基的ncRNA，称为 HOTAIR，它通过 HOXD 基因座的40千碱基抑制转录。HOTAIR与多梳抑制复合体2 (PRC2) 相互作用，是PRC2占位和HOXD 位点组蛋白H3赖氨酸-27三甲基化所必需的。因此，ncRNA的转录可能在一定距离内界定了基因沉默的染色体区域；这些结果对发育和疾病状态下的基因调控具有广泛的意义。
DOI：10.1016/j.cell.2007.05.022
参考文献
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