细胞株构建（稳定细胞系构建）

稳转细胞植株构建的常备技术方法

1、基因过表达稳转细胞细胞系构建

（基因过表达多克隆细胞株构建服务、基因过表达单克隆细胞株构建服务）：

因过表达细胞株构建服务包括目的基因过表达慢病毒载体构建、病毒包装、细胞转染和筛选。客户只需提供目的基因的cDNA质粒和需要构建的细胞系，我们将按照您的要求完成目的基因过表达细胞株的构建和检测，提供给您高质量的基因过表达稳定细胞株。

2、RNA基因敲减稳转细胞株筛选

（RNA干扰基因敲减细胞株多克隆构建服务、RNA干扰基因敲减细胞株单克隆构建服务）：

我司的RNAi基因敲减细胞系构建基于慢病毒表达系统，一般采用U6启动子驱动的pLVshRNA-puro或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体构建RNA干扰稳定细胞株，服务内容包括干扰载体构建、靶点筛选、干扰效率验证及稳定细胞筛选和克隆。

3、CRISPR基因敲除稳定细胞株构建服务：

随着TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系统的出现，基因定点敲除的难度大幅下降。全新的技术将基因敲除从价格高昂，耗时漫长的ZNF系统，逐渐变成简便的研究工具。现在我们可提供Talen和Cas9/gRNA两个系统的基因敲除服务。包括基因敲除靶点设计，TALEN质粒组装，Cas9/gRNA质粒构建及基因敲除效率验证。

稳定细胞株筛选方法

1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：

对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。

另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。

2、病毒感染筛选稳定细胞株：

病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。

稳转细胞株的一般服务流程

1. 载体构建&病毒包装

一般而言，将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，然后对质粒表达进行检测，通过包装获得过表达目的基因的慢病毒质粒。慢病毒载体系统的包装成分与载体成分一起转染293细胞进行包装；百思特网24至48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行滴度测试。

图1 病毒包装&细胞感染百思特网

2. 细胞转染

常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素(Puromycin)、潮霉素(Hygromycin)和新霉素(Neomycin)。首先确定Puromycin/G418的筛选浓度和病毒转染浓度，然后病毒悬液转染细胞24h,Puromyc百思特网in/G418筛选稳转株，ELISA和WB法鉴定。

3. 单克隆化

使用Molecular ClonePix2系统,高通量、自动化的筛选出100-200个高水平分泌克隆，并从中挑选最佳10个高产克隆，进行下一步的稳定性测试。

4. 细胞系稳定筛选

细胞株多次传代数次后，就有可能会出现遗传不稳定性。我们挑选出最优的10个克隆，进行10次传代后，qPCR和WB法检测细胞株的稳定性。最后我们提供序列及载体报告, 3株表达最好的细胞株，表达分析、稳定性测试报告以及详细的稳定细胞株构建报告。