血球计数仪（全自动血球计数仪）

血球计数仪（全自动血球计数仪）

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01清洁实验环境

• 将消毒液彻底喷洒在层流安全柜内，并用纸巾擦干净。将用过的纸巾放入适当的垃圾桶中。

• 将7百思特网0%的乙醇喷洒安全柜内，并用纸巾擦干净。安全柜现已清洁，可供使用。

02处理细胞悬液

• 从冰箱中取出细胞培养基和胰蛋白酶，放入37℃的二氧化碳培养箱中使其升温。

• 使用显微镜观察待计数细胞，检查是否有可见的细菌和真菌污染迹象。

• 用70%的乙醇喷洒培养基瓶和移液管，放入安全柜内。

• 轻轻晃动培养基瓶以确保悬浮细胞充分混合

• 在悬浮细胞发生沉淀之前，取0.5毫升的细胞悬液样本，保存在无菌微量离心管中。

• 去除贴壁细胞上残留的培养基。

• 用常温的DPBS溶液洗涤，加入EDTA胰蛋白酶使细胞分离(DPBS溶液和蛋白酶的用量见表)。

• 放置到37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养2~5分钟。（培养时长视细胞类型而定）。

• 取出放倒置显微镜下进行观察，发现胞突回缩、细胞间隙增大以及细胞从培养瓶底分离为单个细胞。

• 待所有细胞分离完成，37摄氏度含有10%胎牛血清的培养基中和EDTA胰蛋白酶（用量见表）。

• 上下晃动细胞悬浮液三次，使细胞复苏，然后转移到15毫升的试管中。

• 在室温下，以每分钟1000转的速度，离心细胞悬浮液，持续5分钟。

• 离心结束后，弃去细胞混悬液。

• 然后用37摄氏度含有10%胎牛血清的培养基使细胞颗粒悬浮至原始培养体积。

• 用5毫升的无菌移液管取0.5毫升的细胞悬液样本转移到无菌微量离心管中。

03准备血球计数器

• 如果使用玻璃血球计数器和盖玻片，请在使用前用酒精清洁。用水润湿盖玻片，并将盖玻片固定到血球计数器上。如果盖玻片下出现牛顿折射环，则表明盖玻片已正确附着。

• 如果使用一次性百思特网血球计数器（例如 INCYTO DHC-N01），只需在使用前将其从包装中取出。

04开始计数

• 取 100 L 细胞放入新的微量离心管中，加入 400 L 0.4% 台盼蓝（最终浓度 0.08%），轻轻混合。

• 小心地将一滴悬浮液滴入计数室的孔中，使细胞悬液通过毛细管作用被吸入。

• 使用倒置显微镜，在 10x 物镜下对焦到血球计数器的4*4网格线上。计数未被染色的活细胞计数。

• 计数时，只计方块内或右边界及下边界线上的细胞。

• 按同样的方法，必要时也可计数台盼蓝染色的死细胞以估计活细胞的比例。

• 移动血球计数器到下一组方块（16个），继续计数，直至所有 4 组方块（每组16个）均计数完毕。

05计算活细胞数量

• 计算每组方块（16个）中细胞计数的平均值并记录它们的值来计算细胞浓度。

• 取4组16个方格中活细胞的平均数，乘以10000，得到每毫升的细胞数。

• 乘以5，以修正加入台盼蓝时的 1:5 稀释。最终值即是原细胞悬液中的活细胞数量/mL。例：

• 如果每 16 个方块的细胞计数是 50、40、45、52，则平均细胞计数为：

• (50 + 40 + 45 +52) 4 = 46.75

• 46.75 x 10000 (104) = 467500

• 467500 x 5 = 原细胞悬液中 2337500 个活细胞/mL

06计算细胞活力

• 将活细胞和死细胞计数相加，得到总细胞计数。

• 活细胞计数除以总细胞计数即计算出百分比活力。

例：

活细胞计数：2337500 个细胞/mL

死细胞计数：50000 个细胞/mL

2337500 + 50000 = 2387500 个细胞

2337500 2387500 = 97.9%百思特网 活力

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