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细胞检测(中国七大干细胞库)

细胞检测(中国七大干细胞库)

时间:2021-04-09 00:29:07 来源:百思特网 作者:best456

细胞检测(中国七大干细胞库)

细胞增殖作为活细胞的重要生理功能之一,是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。细胞增殖研究方法有很多,那么,今天给大家分享的检测方法都有哪些?话不多说往下看哈~

MTT分析法

MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。

实验方法:

接种XXX细胞用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200 L。培养细胞同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。呈色培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5 mg/mL用PBS配)20 L。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 L DMSO,振荡10 min,使结晶物充分溶解。比色选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

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XTT

XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物,可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物,当XTT与电子耦合剂共同使用时,甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。

实验方法:

首先配置6.6 mmol/L XTT溶液和220 mmol/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)溶液。临用时将XTT与PMS按1:1混合,形成XTT/PMS。接种XXX细胞:用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200 L。培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。于终止培养前2 h,每孔加入XTT/PMS 20L,混匀后再培养2 h。在酶标仪上450 nm处测定光吸光度,参考波长为655nm。

WST-1

此法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度、高稳定性且无放射性的比色检测法。实验的灵敏度比其它四唑盐如MTT,XTT,MTS高,线性范围更宽。

实验方法:

在96孔板加入XXX细胞100 L/孔(约1104),置37℃ 5% CO2细胞培养箱培养24小时。加入适当浓度的受试化合物。将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒,向各孔中加入10 L的四唑盐工作液。37℃下孵育1~4小时。酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。

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CCK-8(WST-8)

CCK-8是近年新开发的一种更新的水溶性四唑盐检测,原理与WST-1类似:在电子载体1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-Methoxy PMS)的作百思特网用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄百思特网色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量,在一定细胞数量范围内甲臜形成的量与细胞数成正比。

实验方法:

在96孔板中接种细胞悬液(100 L/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。细胞经处理后。向每孔加入10 L CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1~4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10L 0.1M的HCl溶液或者1%w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

平板克隆形成

平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。

实验方法:

取对数生长期的单层培养的XXX细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5%CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2~3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15min。然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10~30min,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数100%。

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软琼脂克隆形成

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

实验方法:

取对数生长期XXX细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固。按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2DMEM培养基(含有2抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充百思特网分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37℃5%CO2温箱中培养10~14天。把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。

BrdU

BrdU是胸腺嘧啶的衍生物,常用于标记活细胞中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。这种掺入可以稳定存在,随着DNA复制进入子细胞中。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。

实验方法:

将细胞密度为1.5105/mL的XXX细胞接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1天,用含0.4%FBS培养液同步化3天,使绝大多数细胞处于G0期。加入BrdU(储液:1.0mg/mL,终浓度为0.03g/mL),37℃,孵育40min。弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。甲醇/醋酸固定10min。经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。5%正常兔血清封闭。甲酰胺100℃,5min变性核酸。冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。按免疫组织化学常用的检测方法ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数LI。

有关细胞增殖的研究方法分享今天就到这里,记得转发收藏,下期给大家分享细胞转移哦~

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